Numéro
J. Phys. France
Volume 45, Numéro 3, mars 1984
Page(s) 517 - 527
DOI https://doi.org/10.1051/jphys:01984004503051700
J. Phys. France 45, 517-527 (1984)
DOI: 10.1051/jphys:01984004503051700

Electron microscopy and diffraction study of phospholipid monolayers transferred from water to solid substrates

A. Fischer et E. Sackmann

Technical University of Munich, Physics Department (E22), D-8046 Garching, F.R.G.


Abstract
Monomolecular films of phospholipids (phosphatidylcholines and phosphatidicacids) and arachidonic-acid were transferred from air/water interface onto electron transparent hydrophilic substrates such as 1) carbon films, 2) crystalline graphite-oxide layers, 3) SiO2-covered Formvar foils and were studied by conventional transmission electron microscopy (TEM), by scanning transmission STEM in the darkfield mode and by electron diffraction. Positive staining with uranylacetate and platinum shadowing, using a low angle of incidence, was applied. The latter allowed measurements of the thickness of the transferred lipid layers to an accuracy of 10 %. Imaging of monolayers in the transmission mode at magnifications of x 2 000-50 000 was achieved for the first time. Electron diffraction patterns were taken from layers which in all cases have been characterized simultaneously by conventional EM. The structure of monolayers transferred 1) from the completely condensed solid state, 2) from the intermediate state, 3) from the expanded (fluid) state and 4) from the region of the main phase transition are compared. Evidence is provided that the state of the monolayer on the air-water interface is at least partially preserved upon transfer. In the completely condensed state macroscopically continuous monolayers are formed by fatty acids and phosphatidic acid. The chains form a triangular lattice (lattice constant d100 = 4.2 A; area per molecule 40 Å 2) and are oriented normal to the surface. The transferred phosphatidylcholines exhibit a spider's web of elongated 100 Å wide cracks. This lipid is tilted with respect to the monolayer normal by about 20 degrees and forms and orthorhombic lattice both at the air/water interface and on substrate. A comparison of the radial widths of the electron diffractions of the monolayer with that of graphite oxide substrates provides evidence that the high pressure phase of all lipids do not exhibit a true long-range order of the chains. In the intermediate pressure region - also called fluid condensed region - the film consists of an accumulation of platelets of about 1 μm diameter which according to electron diffraction - are certainly crystalline on the substrate. The large size of the platelets shows that the bulk of the monolayer is also crystalline on the water surface, while a small fraction may still be in the fluid state. The fluid-like viscosity of the intermediate phase is attributed to the low shearing strength of the accumulation of platelets. The 2nd order like transition into the completely condensed crystalline phase is attributed to the merging of the platelets. Evidence is provided that in the region of main phase transition the monolayer consists of fluid and crystalline domains of some 100 A diameter. The finite slope of the isotherm at the main transition is thus not an artefact but is due to the finite size of the cooperative unit undergoing a simultaneous transition. This confirms our previous interpretation and a recent Monte-Carlo study of the nature of the phase transition by Georgallas and Pink (Can. J. Phys. 60 (1982) 1678).


Résumé
Des films monomoléculaires de phospholipides (phosphatidylcholine et acide phosphatidique) et acide arachidique ont été transférés d'une interface air/eau sur des substrats hydrophiles transparents aux électrons tels que 1) films de carbone, 2) couches cristallines de graphite oxydé, 3) feuilles de Formvar recouvertes de SiO2. Ces films ont été étudiés en microscopie électronique par transmission, soit conventionnelle soit à balayage en fond noir annulaire, et aussi en diffraction électronique. Une coloration positive à l'acétate d'uranyl, accompagnée d'un ombrage au platine sous incidence rasante, a été effectuée. Cette dernière méthode a permis de mesurer l'épaisseur des couches lipidiques transférées avec une précision de 10 %. On a observé pour la première fois des monocouches dans le mode en transmission sous des grandissements variables de x 2 000 à 50 000. Des schémas de diffraction électronique ont été enregistrés à partir de films qui, dans tous les cas, ont été caractérisés simultanément par microscopie conventionnelle. Nous avons comparé la structure des monocouches déposées à partir de 1) l'état solide complètement condensé, 2) l'état intermédiaire, 3) l'état fluide expansé, et 4) la région où se place la principale transition de phase. Nous montrons que l'état de la monocouche à l'interface air/eau est au moins partiellement préservé lors du dépôt. Dans l'état complètement condensé, les acides gras et phosphatidiques forment des monocouches macroscopiquement continues. Les chaînes forment un réseau triangulaire (paramètre d100 = 4,2 Å ; surface par molécule 40 Å2) et sont orientées perpendiculairement à la surface. Les phosphatidylcholines déposées présentent un réseau de fractures larges de 100 A en toile d'araignée. Ce lipide est incliné d'environ 20 degrés par rapport à la normale à la monocouche et forme un réseau orthorhombique aussi bien à l'interface air/eau que sur le substrat. Une comparaison des largeurs radiales des raies de diffraction de la monocouche avec celles des substrats de graphite oxydé montre que la phase à haute pression de tous les lipides ne présente pas de véritable ordre à longue distance des chaines. Dans la région de pression intermédiaire - également appelée région fluide condensé -, le film consiste en une accumulation de petites plaques d'environ 1 μm de diamètre qui - du moins selon la figure de diffraction électronique - sont certainement cristallisées sur le substrat. La grande taille des plaquettes montre que le coeur de la monocouche est également cristallisé à la surface de l'eau tandis qu'une petite partie peut rester à l'état fluide. La viscosité de type liquide de la phase intermédiaire est attribuée à la faible résistance au cisaillement de l'agrégat de plaquettes. La transition du type second ordre vers l'état complètement cristallisé est attribuée à l'apparition des plaquettes. Dans la région où se produit la transition de phase principale, nous montrons que la monocouche est formée de domaines fluides et cristallisés d'environ 100 A de diamètre. La pente finie de l'isotherme à la transition n'est donc pas un artefact mais résulte de la taille finie des unités individuelles qui transitent de façon coopérative. Ceci confirme notre précédente interprétation ainsi qu'une récente étude par la méthode de Monte-Carlo de la nature de la transition de phase due à Georgallas et Pink, Can. J. Phys. 60 (1982) 1678.

PACS
8716D - Membranes, bilayers, and vesicles.

Key words
biomembranes -- electron diffraction examination of materials -- lipid bilayers -- monolayers -- scanning transmission electron microscope examination of materials -- transmission electron microscope examination of materials