Numéro
J. Phys. France
Volume 48, Numéro 12, décembre 1987
Page(s) 2139 - 2151
DOI https://doi.org/10.1051/jphys:0198700480120213900
J. Phys. France 48, 2139-2151 (1987)
DOI: 10.1051/jphys:0198700480120213900

Dynamic reflection interference contrast (RIC-) microscopy : a new method to study surface excitations of cells and to measure membrane bending elastic moduli

A. Zilker, H. Engelhardt et E. Sackmann

Physik Department, Biophysics Laboratory E22, Technische Universität, München, D-8046 Garching, F.R.G.


Abstract
A new method, the dynamic reflection interference contrast (RIC) microscopy is presented by which thermally excitated surface undulations of erythrocyte plasma membranes - the cell flickering - can be evaluated to an amplitude resolution of ≤ 50 nm and a wavelength resolution of 0.5 μm. The Newtonian interference pattern formed by the interference of light reflected from the cell surface and from the cover glass (to which the cells are slightly fixed) is analysed by a home made fast image processing system. Two evaluation procedures are proposed : firstly the direct reconstruction of the momentaneous surface profile by retransformation of the RIC interference pattern and secondly the Fourier analysis of the interference pattern. In the first case the excitation relief is obtained by subtraction of two momentaneous surface profiles and it is best suited in the long wavelength regime. In the second case the spatial frequency spectrum of the flickering is determined by Fourier transformation of the RIC interference pattern. This technique is reliable in the short wavelength regime and is used here to determine the bending elastic modulus, Kc, in a wave length domain between 0.5 and 1 μm. This simultaneous determination of many Kc-values greatly enhances the accuracy of the measurement. This procedure is also suited to test whether the flickering obeys the equipartition law. The elastic constants of normal discocytes, of cup-shaped stomatocytes and of echinocytes are compared. The values of the first two classes are about equal : Kc = 3.4 ± 0.8 x 10-20 Nm and agree well with values reported previously [1]. The last cell shape exhibits a substantial higher stiffness Kc = 13 ± 2 × 10-20Nm. An outstanding advantage of the dynamic RIC-microscopy is that it allows to measure absolute values of the displacement of the membrane facing the coverslide whereas the conventional flicker spectroscopy [1, 8] can only detect fluctuations of the cell thickness. A second advantage is that it can also be applied to erythrocyte ghosts or to other transparent cells.


Résumé
On présente une nouvelle méthode, la microscopie dynamique par réflexion et contraste interférentiel (RIC), qui permet de mesurer les ondulations thermiques des membranes d'érythrocytes avec une résolution en amplitude inférieure à 50 nm et une résolution en longueur d'onde de 0,5 μm. On analyse la figure d'interférences formée par la lumière réfléchie sur la surface de la cellule interférant avec celle de la lame de verre à laquelle les cellules sont attachées. On propose deux procédures pour l'évaluation de cette figure : d'une part la reconstruction directe du profil instantané de la surface par retransformation de la figure d'interférences RIC, d'autre part l'analyse de Fourier de cette figure d'interférences. Dans la première procédure, le relief créé par les excitations thermiques est obtenu par soustraction de deux profils de surface instantanés; cette méthode est applicable aux excitations de grande longueur d'onde. Dans la deuxième, on détermine la fréquence spatiale du scintillement par transformée de Fourier de la figure d'interférences RIC. Cette technique est applicable aux excitations de courtes longueurs d'onde ; nous l'utilisons pour déterminer la constante élastique de flexion Kc des excitations de longueurs d'onde comprises entre 0,5 et 1 μm. Cette mesure simultanée de plusieurs valeurs de Kc augmente substantiellement la précision de la mesure. On peut aussi vérifier par cette procédure que les scintillements observés suivent bien la loi d'équipartition. Nous comparons les constantes élastiques des discocytes normaux, des stomatocytes en forme de coupe et des échinocytes. Les valeurs obtenues pour les deux premières classes de cellules sont presque égales: Kc = 3,4 ± 0,8 x 10- 20 Nm. Les cellules de la troisième catégorie sont beaucoup plus rigides : Kc = 13 ± 2 x 10-20 Nm. L'avantage principal de la microscopie dynamique RIC est qu'elle permet la mesure des valeurs absolues du déplacement de la membrane qui fait face à la lame de verre, tandis que la spectroscopie de scintillement conventionnelle ne détecte que les fluctuations d'épaisseur de la cellule. L'autre avantage est qu'on peut également l'appliquer aux érythrocytes fantomes et aux autres cellules transparentes.

PACS
0760L - Interferometers.
8780 - Biological techniques and instrumentation; biomedical engineering.

Key words
biological techniques and instruments -- biomembranes -- cellular biophysics -- light interferometry -- optical microscopy